رعایت نکات زیر برای آزمایش کلسیم ضروری است

موقعیت بیمار در هنگام نمونه گیری:

تغییر موقعیت بیمار از حالت خوابیده به نشسته یا ایستاده ، سبب خروج (efflux) آب و مایعات و مواد محلول قابل عبور از داخل عروق به فضای بینابینی سلولها می گردد. مواد غیر قابل عبور از دیواره عروق مثل پروتئین ها ، سلولها ، مواد باند شده به پروتئین ها و سلولها تغلیظ می شوند. مثلا آلبومین سرم افزایش یافته و کلسیم چون به آلبومین باند شده ، افزایش می یابد.

برای تغییر وضعیت از حالت خوابیده به نشسته ، تغییر میزان کلسیم % 4 + خواهد بود.

رژیم غذایی (diet) :

مثلا پس از نوشیدن مقدار زیادی شیر ، مقدار کلسیم سرم افزایش می یابد.

بستن تورنیکت و باز و بسته کردن مشت :

بستن تورنیکت ، سبب برجسته شدن وریدها و تسهیل خونگیری می شود . کاربرد نامناسب تورنیکت و باز و بسته کردن مشت ، باعث خطا در تست ها می شود. باز و بسته کردن مشت و پمپ کردن دست (pumping) در طی نمونه گیری سبب افزایش غلظت پتاسیم ، لاکتات و فسفر می شود. با افزایش لاکتات خون ، PH خون کاهش یافته و غلظت کلسیم یونیزه سرم بالا می رود.

خونگیری از بیماری که به دست او سرم (IV) وصل شده است :

چون ترکیبات موجود در سرم تزریق شده ، باعث تغییر غلظت مواد شیمیایی شده یا آنها را رقیق می کنند ، لازم است حتی الامکان از بیماری که سرم به او تزریق می شود ، خونگیری نشود. در صورت نیاز به خونگیری ، لوله تزریق سرم بسته شود و از دست دیگر بیمار نمونه گیری شود. در صورتیکه لازم باشد از همان دست محتوی سرم خونگیری شود به ترتیب زیر عمل نمایید :

لوله سرم بسته شود ، تورنیکت زیر محل Needle سرم بسته شود و خون از وریدهای زیر ناحیه تزریق سرم گرفته شود. اگر بخواهیم از برانول خونگیری کنیم ، سرم را بسته و چند میلی لیتر اول خون گرفته شده را دور ریخته و از باقیمانده آن برای انجام آزمایشات استفاده شود.

مواد ضدانعقاد (Anticoagulants) :

استفاده نامناسب از مواد ضدانعقاد باعث تغییرات زیادی در تستهای بیوشیمیایی می گردد. اکسالات ها ، سیترات سدیم و EDTA سبب کاهش کلسیم سرم به روش اسپکتروفتومتری می شوند.

سرم های لیپمیک یا کدر (Lactascent serum) :

افزایش تری گلیسرید سرم باعث تداخل در اندازه گیری سایر موادی که از همان طول موج ، جذب نوری دارند می گردد ؛ از جمله باعث افزایش کلسیم به روش CP (Cresol phetalein)
می گردد.

برای تصحیح اثرات سرم لیپمیک از بلانک سرم استفاده می شود. حتی سرم بلانک هم قادر به حذف کامل همه این تداخل ها نمی باشد.



نکاتی در مورد آزمایش کلسیم :

در اندازه گیری کلسیم به طریق کرزوفتالئین تا مقدار 0.2 gr هموگلوبین در 100 ml سرم ، اثر تداخلی چندانی دیده نمی شود. در مقادیر بیشتر Hb آزمایش باید در مقابل سرم بلانک ، اندازه گیری و اصلاح گردد.
1% همولیز باعث افزایش کلسیم به میزان 2.9 % می گردد.
با توجه به اینکه کلسیم یونیزه به جایگاههای اتصالی با بار منفی متصل می شود ، یون هیدروژن برای اتصال به آلبومین و دیگر پروتئین های متصل شده به کلسیم با کلسیم رقابت می کند و اتصال آنها وابسته به PH می باشد. اگرچه سطوح کلسیم تام سرم ممکن است بدون تغییر باقی بماند ، انتشار نسبی 3 فرم کلسیم که در اثر تغییرات PH در ECF رخ می دهد قابل تغییر است. آلکالوز باعث افزایش اتصال کلسیم به پروتئین شده در نتیجه سبب کاهش کلسیم آزاد می شود ، در حالیکه اسیدوز با کاهش اتصال کلسیم به پروتئین ، سطح کلسیم آزاد را افزایش می دهد. سطح کلسیم تام به وسیله غلظت پروتئین پلاسما قابل تغییر است.
کاهش 1 gr/dl آلبومین ، معادل کاهش 0.8 mg/dl کلسیم خواهد بود.
بیماران دارای بدخیمی اغلب تظاهرات هیپوآلبومینمی دارند که این وضعیت ممکن است بطور کاذب سطح کلسیم تام را کاهش دهد. در این شرایط سطح کلسیم تام (بر حسب mg/dl) به وسیله معادله زیر تصحیح می شود :

= کلسیم تام (mg/dl) تصحیح شده برای هیپوآلبومینم

[0.8 × (آلبومین بیمار- آلبومین طبیعی)] + کلسیم تام (اندازه گیری شده)

(در این فرمول معمولا مقدار آلبومین طبیعی را 4.4 در نظر می گیرند)
درصد کمی از کلسیم به دیگر پروتئین ها از قبیل γ- گلبولین ها متصل می شود. بنابراین در حالات بالینی مانند هیپوگاماگلبولینمی ، سطح کلسیم تام به شدت تغییر می کند.
از سرنگ و ظروف شیشه ای باید اجتناب کرد زیرا کلسیم به بدنه ظروف شیشه ای می چسبد.
افزایش کاذب کلسیم به دلیل استاز وریدی در حین خونگیری و نگهداری طولانی مدت خون حاصل می شود.
در روش O-Cresophtalein Complex دما بایستی به دقت کنترل شود زیرا این روش به دما بسیار حساس است.
در روشهای فتومتریک هر نوع ظروف شیشه ای یا پلاستیکی باید با اسید کلریدریک رقیق شسته شوند.
ضد انعقادهای سیترات ، اگزالات و EDTA نباید مصرف شوند ، به این دلیل که با تشکیل کمپلکس با کلسیم تداخل ایجاد می کنند.
کلسیم یونیزه وضع متابولیسم کلسیم را بهتر از مقادیر کلسیم تام بیان می نماید و بدین علت اکثر پزشکان آزمایش CaI را نسبت به کلسیم تام ترجیح می دهند.
تکرار اندازه گیری کلسیم تام سرم برای تشخیص هیپرپاراتیروئیدیسم لازم است (وقتی کلسیم نرمال و کلسیم یونیزه افزایش یافته است).
عوامل مداخله گر در اندازه گیری کلسیم با روشهای رنگ سنجی عبارتند از :همولیز – زردی – لیپمی – پاراپروتئین ها و منیزیوم.
نمونه سرم ، بهترین نمونه برای سنجش کلسیم تام است اگرچه پلاسمای هپارینه نیز مورد قبول است.
از خون تام ، پلاسمای هپارینه یا سرم برای اندازه گیری کلسیم آزاد استفاده می شود. تمامی نمونه ها باید در شرایط بیهوازی جمع آوری شوند و در یخ 4C انتقال یابند تا از حذف CO2 و گلیکولیز جلوگیری شده و PH تثبیت شود(تغییرات PH نسبت کلسیم یونیزه را تغییر می دهد).
در آلکالمی متابولیک یا تنفسی ، با وجود کلسیم تام نرمال (وقتی کلسیم نرمال و کلسیم یونیزه افزایش یافته است)
پایین بودن سطح سرمی کلسیم و افزایش سطح اسید اوریک از یافته های شایع همراه با پره اکلامپسی است.

(پره اکلامپسی یکی از عوارض شایع بارداری و عامل ایجاد صدمه به جنین و مادر است. این بیماری اغلب در زنان جوان و نخست زا (Primigravida) دیده شده و علائم آن در اواخر حاملگی بارز می شود).


مقادیر مرجع در افراد بالغ طبیعی
mg/dl
mmol/l

کلسیم تام
8.8-10.3
2.2-2.58

کلسیم یونیزه (آزاد)
4.6-5.3
1.16-1.32




علل هیپرکلسیمی:
- به علت PTH

هیپرپاراتیروئیدیسم اولیه (علت شایع) :

اسپورادیک

نئوپلازی اندوکرین متعدد (نوع 1 و 2)

هیپرکلسیمی هیپوکلسیوری فامیلی

ترشح نابجای PTH به وسیله نئوپلاسم ها (نادر است)

- مستقل از PTH :

همراه بدخیمی ها (علت شایع)

به علت ویتامین D :

مسمومیت با ویتامین D

افزایش تولید D 21,25(OH)

عوامل دیگر اندوکرینوپاتی :

تیروتوکسیکوز

هیپوآدرنالیسم

بی تحرکی همراه با بازگردش استخوان

سندرم شیر – قلیا

سارکوئیدوز

مولتیپل میلوما



علل هیپوکلسیمی :

- به علت PTH

کمبود PTH

دائمی :

اکتسابی : بعد از جراحی

ارثی :

هیپوپاراتیروئیدیسم ایدیوپاتیک

سندرم دی جرج

سندرم های اتوایمیون چند غده ای

معکوس و راجعه :

هیپومنیزیومی شدید

هیپرکلسیمی

مقاومت به PTH

هیپوپاراتیروئیدیسم کاذب

- به علت ویتامین D

کمبود ویتامین D

کمبود D 25(OH)

کمبود D 21,25(OH):

مهار برگشت پذیر 1- هیدروکسیلاز

اختلالات داخل کلیوی (آسیب کلیوی مزمن ، بیماری توبول ها و سندرم فانکونی)
اختلال در پاسخ به D 21,25(OH)
جهش در گیرنده ویتامین D

يكي از تست هاي تشخيصي مهم جهت تأئيد وجود بتا تالاسمي مينور تعيين درصد هموگلوبين A2  مي باشد .هموگلوبين A2را می توان به روش های زیر اندازه گيری نمود:
 - کروموتوگرافی تعويض يونی
   1-ستون ميکرو
   2-HPLC (کروماتوگرافی تعويض يونی کاتيونيک)
- الکتروفورزاستات سلولز همراه با الوشن
اندازه گيری هموگلوبين A2  با استفاده از ستون ميکرو
كروماتوگرافي تعويض يوني از انواع كروماتوگرافي هاي مايع – جامد بوده كه بر اساس واكنش متقابل گروههاي باردار مولكول هموگلوبين و رزين ، جداسازي صورت مي گيرد. بر روي رزين يونهايي وجود دارد كه قابل تعويض با يونهاي همبار خود در هموليزات مي باشند. در اين روش از رزين آنيونيك دي اتيل امينواتيل سلولز DEAE52  استفاده مي گردد.

اساس روش :
1-    تورم رزين با بافر و به تعادل رسيدن آن با بافر تا PH رزين به PH بافر برسد
2-    اضافه نمودن هموليزات به ستون
3-    جداسازي انتخابي اجراي نمونه بوسيله تغيير PH یا قدرت يونيك بافر
در اندازه گيري هموگلوبين A2 به روش كروماتوگرافي ستوني با استفاده ازستون ميکرومي توان از بافر گلایسين يا بافر تريس استفاده نمود.

1)    روش گلايسين : بافر اول تركيبي از گلايسين و سيانور پتاسيم (KCN) مي باشد و بافر دوم همان تركيب بافر اول به همراه كلرور سديم مي باشد كه با اضافه نمودن نمك به بافر دوم قدرت يوني آن افزايش يافته و ساير هموگلوبين ها را از ستون خارج مي سازد. PH رزين بايد توسط HCL يك مولار و به كمك PH متر طوري تنظيم شود كه پائين تر از نقطه ايزوالكتريك هموگلوبين A2 بوده و بالاتر از نقطه ايزوالكتريك ساير هموگلوبين ها باشد ، لذا بلافاصله پس از جذب هموليزات به روی رزين و اضافه نمودن بافر اول ، هموگلوبين A2 بصورت يك حلقه از ستون خارج مي شود ، سپس با اضافه كردن بافر دوم ، با افزايش قدرت يوني ، ساير هموگلوبين ها نیز از ستون خارج مي شوند.

2)    روش تريس : روش پيشنهادي NCCLS مي باشد. از محلول ذخيره تريس سه بافر با PH 5/8 ، 3/8 ، 7  به كمك HCL غليظ تهيه مي گردد. جداسازي در اين روش بر اساس تغيير در PH  بافر صورت مي گيرد. در اين روش PH بافر دوم ( 3/8 ) بسيار مهم مي باشد ( در اين PH هموگلوبين A2 از ستون خارج مي شود )
   اين روش بدليل استفاده از بافرهاي متعدد ( 3 بافر ) در آزمايشگاهها كمتر مورد استفاده            قرار مي گيرد. قابل ذكر است كه درصد هموگلوبين A2 با استفاده از بافر تريس مختصري پائين تر از روش استفاده از بافرگلایسین میباشد.هم چنین در مقایسه با روش تريس ، بافر گلایسين حساسيت كمتري به تغييرات مختصر PH دارد.

با تهيه رزين با بافر گلايسين و PH مناسب جهت جداسازي هموگلوبين A2 مي توان نمونه هايي كه حاوي هموگلوبين S میباشند را نيز جدا كرد. ( طول رزين داخل ستون بايد افزايش يابد )
 بدليل عدم ساخت رزين و بافر در آزمايشگاهها مراحل كنترل كيفي آن ذكر نميگردد.

اکثركيت هاي اندازه گيري هموگلوبين A2 موجود در ايران بر اساس كروماتوگرافي تعويض يوني با استفاده از بافر گلايسين مي باشد که جدا سازی هموگلوبين A2 بافر دوم به کمک  بافر اول يا همان محلول Developer صورت می گيرد.با تهيه لولـه تـوتال ( آب مقطر به همراه هموليزات ) بجای استفاده از بافر دوم درصد هموگلوبين A2 محاسبه مي گردد.

روش كار : با توجه به دستورالعمل درون كيت مي باشد لذا از ذكر آن خودداري مي گردد.
3)    *دستور العمل داخل کیت باید بدقت خوانده شود.

تهيه نمونه : خون به همراه ماده ضد انعقاد EDTA مناسب مي باشد. حداكثر زمان نگهداري خون در دماي چهار درجه ( يخچال ) 8 روز مي باشد . بهتر است هموليزات تازه و در روز آزمايش تهيه شود.

 * نكات مهم در نقل و انتقال كيت هموگلوبين A2

1-    رعايت زنجيره سرد ( در مورد كيت هايي كه بايد حتما" در يخچال نگهداري شوند )
2-    بررسي صاف بودن ستونهاي داخل كيت ( سر و ته نبودن ستونها )


*   رعايت نكات زير در هنگام اندازه گيري هموگلوبين A2 توصيه مي گردد:

1- در صورتي كه ژل داخل ستونها تغيير رنگ داده باشند نبايد مورد استفاده قرار گيرند
2- قبل از استفاده ازستونها و بافر بايد حتما" به دماي اتاق برسند. (در مورد کيت هايی که در دمای يخچال نگه داری می شوند)
3- بهتر است ازپي پت پاستور تميزو يا سمپلربا نوك نو جهت مخلوط نمودن رزين داخل ستونها با بافر و حل شدن حبابهای هواي داخل رزين استفاده نمود.
4- ستونها بايدا زيك Flow rate  مناسب برخوردار باشند  ، 10-20  5- قبل از تهيه هموليزات بايد نمونه خون تام كاملا" مخلوط شود .
6- پس از تهيه هموليزات بهتر است سريعتر كروماتوگرافي انجام شود ( پس از ليز كامل گلبول هاي قرمز )
7- قبل از نمونه گذاري به هيچ وجه نبايد رزين خشك شود. به محض اينكه محلول روِیی رزين خارج شد بايد هموليزات به ستون اضافه شود.
8-از سمپلر کالبیره باید جهت برداشت نمونه خون، بافرو همولیزات استفاده نمود.
9-باید از لوله های مدرج استاندارد جهت جمع آوری هموگلوبین A2 از ستون و تهیه لوله توتال استفاده نمود.در صورت عدم دسترسی به لوله های فوق لوله های معمولی را به روش دستی (قلم الماس ،ماژیک) مدرج نمائید.
10- افزودن هموليزات بايد به آرامي و درست در سطح رزين صورت گيرد و سطح آن نبايد در هنگام نمونه گذاري آسيب ببيند.
11- بهتر است از يك نوك سمپلر جهت ریختن هموليزات بداخل ستون و لوله توتال استفاده شود .
12- به محض جذب شدن هموليزات برروی رزين بايد بلافاصله بافر اضافه شود.
13- اگر قبل از جذب كامل هموليزات برروی رزين، محلول بافر ريخته شود باعث كاهش كاذب هموگلوبين A2 مي گردد.
14- بايد دقت شود تمامي بافر اضافه شده از ستون خارج شود.
15- قبل از خواندن جذب نوري ، بايد لوله A2 و توتال كاملا" مخلوط شوند.
16- بايد از يك اسپكتروفتومتر كاليبره جهت خواندن جذب نوري لوله ها استفاده شود.
17- بايد از يك نمونه که هموگلوبين A2 آن مشخص شده است(يا در صورت دسترسی به کنترل تجاری) به عنوان نمونه كنترل در هر سری  كاري استفاده گردد.
در صورتی که نمونه کنترل در محدوده مورد انتظار بخواند ، نيازی به انجام نمونه های بيماران بفرم دوتايي نمی باشد.

دامنه مرجع:
در کتب مرجع پیشنهاد میگردد که هر آزمایشگاه دامنه مرجع خود را با استفاده از حداقل 20 نمونه خون فرد سالم (هموگلوبین واندکس های گلبولی طبیعی ) بدست اورد و تفسیر نتایج هموگلوبين  A2در مقابل این دامنه صورت گیرد.قابل ذکر است که دامنه مرجع ممکن است مختصری در روش های مختلف اندازه گیری هموگلوبين  A2ودر بین آزمایشگاهها متفاوت باشد. (دامنه مرجع ممکن است در روش  HPLC 0.1-0.2% بالاتر باشد.)
بطور معمول دامنه مرجع هموگلوبين A2 برطبق توصیه NCCLS، 5/3-5/1%          می باشد در حالی که کتاب خون شناسی   Dacie3/3-2% را پیشنهاد میکند. در ایران نیز بنظر می رسد که دامنه پیشنهادی فوق قابل قبول تر باشد.
در نهایت بدنبال تعین دامنه مرجع هم ،هنوز مشکلاتی در تفسیر نتایج لبه مرزی Border line وجود دارد.دراین موارد تکرار نتایج نیز ممکن است0.1-0.2% تفاوت نشان دهد.طبق پیشنهاد کتاب خون شناسیDacie بهتراست نتایج 3.4-3.7% هموگلوبین A2  بعنوان لبه مرزی در نظر گرفته شود و هموگلوبین A2  در همان نمونه ویک نمونه مجدد تازه تکرار شود.
* تفسیر نتایج هموگلوبین A2  باید در کنارشمارش گلبولهای قرمز، میزان هموگلوبین، اندکس های گلبولی وبررسی گسترش خون محیطی فرد صورت گیرد.در نهایت در موارد مشکوک و لبه مرزی باید بررسی فامیلی و آزمایش های تکمیلی نظیر جدا سازی زنجیره ها وبررسی DNA صورت گیرد.

دامنه مرجع%    تفسیر
7<    - وجود هموگلوبین  A2به تنهائی بسیار نادر است
- موارد نادر موتاسیونهای β تالاسمی
7-3.8    - صفت  β تالاسمی- هموگلوبین ناپایدار
- صفت هموگلوبین S- آنمی داسی شکل- آنمی مگالوبلاستیک
3.7-3.4    - فقر اهن بسیار شدیدهمراه با صفت  β تالاسمی
- همراهی واریانت های زنجیره دلتا( ς ) با صفت  β تالاسمی
- تاثیر متقابل تالاسمیα و β
- موتاسیونهای نادر  β تالاسمی
- حضور هموگلوبین S  (در این مورد صحت اندازه گیری هموگلوبین A2مشکل می    شود )
-  تاثیر متقابل تالاسمیα و هموگلوبین S
- خطاهای آنالیتیکال(آزمایش باید تکرار شود)
3.3-2    - فرد طبیعی
- دلتا بتا ( ς  β)تالاسمی(اگر هموگلوبین F بالا باشد)
- موارد نادر صفت  β تالاسمی(شامل همراه شدن β با دلتا تالاسمی و α و β تالاسمی)
صفت αتالاسمی  
2>    - دلتا بتا ( ς  β)تالاسمی(اگر هموگلوبین F بالا باشد)
- صفت αتالاسمی 
- بیماری هموگلوبین H
- حضور واریانت های زنجیره دلتا
- این متد برای اندازه گیری هموگلوبین A2 اختصاصی نیست بطوری که بسیاری از هموگلوبین های همبار با هموگلوبین  A2نیز از ستون خارج می شوندکه شامل هموگلوبین C,E,O arab و بعضی از واریانت های هموگلوبین A2 (A'2)و زنجیره دلتا میباشند. لذا هموگلوبین  A2از این هموگلوبین ها قابل تفکیک نیست.
- در مواردی که هموگلوبین A2  بیشتر از 7% می باشد باید به وجود هموگلوبین های C,E,O arab شک نمودکه همراه با هموگلوبین  A2از ستون خارج می شوند.در این مورد نیاز به بررسی تکمیلی نظیر الکتروفورز هموگلوبین در PH=8.4و PH=6-6.2 و بررسی فامیلی می باشد.
- اگرتمامی همولیزات اضافه شده یکباره از ستون پاِیین آید ،باید به وجود سایر هموگلوبینوپاتی ها نظيرهموگلوبین S یا  Dو G و یا هموگلوبین E,C شک نمود.
- اندازه گیری هموگلوبین  A2به روش کروماتوگرافی ستونی نباید در بیمارانی که اخیرا خون دریافت کرده اند صورت گیرد.

در صورت وجود هموگلوبین A2 بیش از 7% در کروماتوگرافی ستونی مراحل زير می بايست انجام گيرد:
1- انجام الکتروفورز استات سلولزدر  PH=8.4تاييد وجود باند پر رنگ در ناحیه هموگلوبین  A2
2- انجام الکتروفورزسیترات اگار در PH=6-6.2     
      الف)در صورت مشاهده باند در منطقه هموگلوبین C بیمار هموگلوبین C دارد که مقدار بدست آمده برای هموگلوبین A2مجموع هموگلوبین  A2و  C است.
      ب)در صورتيکه باندی در منطقه هموگلوبین C دیده نشود  بیماراحتمالا هموگلوبین E ياO دارد که جهت تاییدوجود هموگلوبين E ، آزمایش رسوب با ایزوپروپانول انجام می گردد.
       ج) در صورت مشاهده باندی در منطقه هموگلوبین S   نمونه ممکن است  حاوی هموگلوبینSيا   Harlem –C  باشد،  که جهت تایید وجود هموگلوبين S تست حلالیت انجام می گردد.
        د) اگر باندی در منطقه بین محل نمونه گذاری وباند هموگلوبین S دیده شود  نمونه حاوی هموگلوبین O arab خواهد بود.



  Anode(+)     

       ……..   C           
                                     
                                                  C-Harlem..........    S   
                ……….  O arab     
                                                         .......................Origin       

      D,E,G,Lepore,H,I,N,J     ............A  

    Barts................F  

عبارتند :Fسه روش رايج اندازه گيری کمی هموگلوبين

کاربرد:

عیدتون مبارک